細(xì)胞計(jì)數(shù)法
實(shí)驗(yàn)方法原理：體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂繁殖的能力，可用分裂指數(shù)來表示。它與生長(zhǎng)曲線有一定的聯(lián)系，如隨著分裂指數(shù)的不斷提高，細(xì)胞也就進(jìn)入了指數(shù)生長(zhǎng)期。

分裂指數(shù)指細(xì)胞群體中分裂細(xì)胞所占的百分比，它是測(cè)定細(xì)胞周期的一個(gè)重要指標(biāo)，也是不同實(shí)驗(yàn)研究選擇細(xì)胞的重要依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一、消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接至內(nèi)含蓋玻片的培養(yǎng)皿中。

二、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，使細(xì)胞長(zhǎng)在蓋片上。

三、取出蓋片，按下列順序操作：

PBS漂洗3分鐘→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分鐘→Giemsa液染色10分鐘→自來水沖洗。

四、蓋片晾干后反扣在載玻片上，鏡檢。

五、計(jì)算

分裂指數(shù)=分裂細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%

BrdU參入法
實(shí)驗(yàn)方法原理：細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。

單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。

BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過兩個(gè)細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占1/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個(gè)周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個(gè)周期，則兩條單體均深染。計(jì)分裂相中各期比例，就可算出細(xì)胞周期的值。

一、試劑配制

二、細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)期時(shí)，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使最終濃度為10 μg/ml。

三、44小時(shí)加秋水仙素，使每ml中含0.1 μg。

四、48小時(shí)后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。

五、常規(guī)染色體制片。

六、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6 cm處紫外照射30分鐘。

七、棄去2×SSC液，流水沖洗。

八、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

九、鏡檢100個(gè)分裂相，計(jì)第一、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。

十、計(jì)算

細(xì)胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時(shí)）

細(xì)胞周期（cell cycle)是指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。

1.間期

間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。

（1）G1期

此期長(zhǎng)短因細(xì)胞而異。體內(nèi)大部分細(xì)胞在完成上一次分裂后，分化并執(zhí)行各自功能，此G1期的早期階段特稱G0期。在G1期的晚期階段，細(xì)胞開始為下一次分裂合成DNA所需的前體物質(zhì)、能量和酶類等。

（2）S期

S期是細(xì)胞周期的關(guān)鍵時(shí)刻，DNA經(jīng)過復(fù)制而含量增加一倍，使體細(xì)胞成為4倍體，每條染色質(zhì)絲都轉(zhuǎn)變?yōu)橛芍z點(diǎn)相連接的兩條染色質(zhì)絲。與此同時(shí)，還合成組蛋白，進(jìn)行中心粒復(fù)制。S期一般需幾個(gè)小時(shí)。

（3）G2期

為分裂期做最后準(zhǔn)備。中心粒已復(fù)制完畢，形成兩個(gè)中心體，還合成RNA和微管蛋白等。G2期比較恒定，需用1～1.5小時(shí)。

2.分裂期

細(xì)胞的有絲分裂（mitosis）需經(jīng)前、中、后，末期，是一個(gè)連續(xù)變化過程，由一個(gè)母細(xì)胞分裂成為兩個(gè)子細(xì)胞。一般需1～2小時(shí)。

（1）前期（prophase）染色質(zhì)絲高度螺旋化，逐漸形成染色體（chromosome）。染色體短而粗，強(qiáng)嗜堿性。兩個(gè)中心體向相反方向移動(dòng)，在細(xì)胞中形成兩極；而后以中心粒隨體為起始點(diǎn)開始合成微管，形成紡錘體。隨著核仁相隨染色質(zhì)的螺旋化，核仁逐漸消失。核被膜開始瓦解為離散的囊泡狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

（2）中期（metaphase）細(xì)胞變?yōu)榍蛐?，核仁與核被膜已完全消失。染色體均移到細(xì)胞的赤道平面，從紡錘體兩極發(fā)出的微管附著于每一個(gè)染色體的著絲點(diǎn)上。從中期細(xì)胞可分離得到完整的染色體群，共46個(gè),其中44個(gè)為常染色體,2個(gè)為性染色體。男性的染色體組型為46，XY，女性為46,XX。分離的染色體呈短粗棒狀或發(fā)夾狀，均由兩個(gè)染色單體借狹窄的著絲點(diǎn)連接構(gòu)成。

（3）后期（anaphase）由于紡錘體微管的活動(dòng)，著絲點(diǎn)縱裂，每一染色體的兩個(gè)染色單體分開，并向相反方向移動(dòng)，接近各自的中心體，染色單體遂分為兩組。與此同時(shí)，細(xì)胞波拉長(zhǎng)，并由于赤道部細(xì)胞膜下方環(huán)行微絲束的活動(dòng)，該部縮窄，細(xì)胞遂呈啞鈴形。

（4）末期（telophase）染色單體逐漸解螺旋，重新出現(xiàn)染色質(zhì)絲與核仁；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡組合

為核被膜；組胞赤道部縮窄加深，最后完全分裂為兩個(gè)2倍體的子細(xì)胞。

在體內(nèi)根據(jù)細(xì)胞的分裂能力可把它們分為三類：

①增殖細(xì)胞群，如造血干細(xì)胞，表皮與胃腸粘膜上皮的干細(xì)胞。這類細(xì)胞始終保持活躍的分裂能力，連續(xù)進(jìn)入細(xì)胞周期循環(huán)。

②不再增殖細(xì)胞群，如成熟的紅細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等高度分化的細(xì)胞，它們喪失了分裂能力，又稱終末細(xì)胞（end cell）。

③暫不增殖細(xì)胞群，如肝細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞。它們是分化的，并執(zhí)行特定功能的細(xì)胞，在通常情況下處于G0期，故又稱G0期細(xì)胞。在某種刺激下，這些細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。如肝部分切除術(shù)后，剩余的肝細(xì)胞迅速分裂。

流式細(xì)胞儀
實(shí)驗(yàn)方法原理：流式細(xì)胞儀的工作原理是將待測(cè)細(xì)胞放入樣品管中，在氣體的壓力下進(jìn)入充滿鞘液的流動(dòng)室。在鞘液的約束下細(xì)胞排成單列由流動(dòng)室的噴嘴噴出，形成細(xì)胞柱。通過對(duì)流動(dòng)液體中排列成單列的細(xì)胞進(jìn)行逐個(gè)檢測(cè)，得到該細(xì)胞的光散射和熒光指標(biāo)，分析出其體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理及化學(xué)特征。

細(xì)胞內(nèi)的DNA含量隨細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生周期性變化，如G0/G1期的DNA含量為2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI標(biāo)記的方法，通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA的相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，可分析細(xì)胞周期各時(shí)相的百分比。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液，胰酶適度消化細(xì)胞，用培養(yǎng)液吹打，800 rpm，離心15 min去上清。

二、PBS洗2次，加0.5 mLPBS吹勻，務(wù)必吹散。

三、用5 mL注射器將細(xì)胞吸起，用力打入5 mL 70%(預(yù)冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定過夜（可長(zhǎng)至2周）。

四、800 rpm 15 min收集固定細(xì)胞，PBS洗2次。

五、用0.4 mLPBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)至Tube中輕輕吹打（防止細(xì)胞破碎）。

六、加RNase-A約3 μL至終濃度約為50μg/mL ，37℃水浴消化30 min；

七、加PI約50 μL至終濃度約為65μg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。

八、用300目（孔徑40~50微米）尼龍網(wǎng)過濾，上機(jī)檢測(cè)。

九、樣品分析測(cè)定及打印。

常見問題
1.Q：胃粘膜組織的DNA含量及倍體檢查，取材后要等幾個(gè)星期才會(huì)做流式細(xì)胞術(shù)檢查，請(qǐng)問：胃組織要怎樣保存好呢？用低溫保存，還是用乙醇固定？或者固定后再低溫下保存？

A：以乳腺細(xì)胞的DNA含量測(cè)定為例，取得組織以后，先處理成單細(xì)胞懸液，然后再加70%冰乙醇固定，要保證冰乙醇的最終濃度為50%，這樣固定的細(xì)胞懸液可以至少保存12小時(shí)，最多可保存一個(gè)月，上機(jī)檢測(cè)前再加PI綜合染液。保存了將近三個(gè)星期，結(jié)果還可以，變異系數(shù)為5%.

2.PI分析細(xì)胞周期及凋亡率相關(guān)問題

Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配嗎？

A：RNaseA用PBS配制沒有問題，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。

Q：（2）測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率時(shí)都要用RNAs酶，可以一起檢測(cè)嗎？

A：用流式細(xì)胞儀測(cè)定時(shí)細(xì)胞周期和凋亡率是同時(shí)測(cè)定。

Q：（3）Triton－x－100是固定劑吧，用了70％的冷乙醇（是4℃嗎？），是不是就不用Triton－x－100固定了？

A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定劑，可以用75％的乙醇于-20度固定。

Q：（4）還要設(shè)什么內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)（5％雞紅細(xì)胞）嗎？

A：對(duì)照肯定是需要的，這個(gè)根據(jù)自己的需要進(jìn)行設(shè)置。

3.Q：流式檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)加RNA酶所需的溫度？

A：其實(shí)有關(guān)RNA酶在凋亡檢測(cè)制樣過程中使用的必要性問題尚有人持不同意見，該觀點(diǎn)的人認(rèn)為RNA酶在環(huán)境中無所不在，常規(guī)制樣過程中所接觸的試劑和環(huán)境中的RNA酶已足以降解樣品中的RNA，所以為了簡(jiǎn)便實(shí)驗(yàn)操作，也有人不加RNA酶或如你所參考的方法將其與PI染液一起使用。不過經(jīng)典的方法還是“先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI 4度孵育30min”。至于染色時(shí)使用4度，是因?yàn)榈蜏乜蓽p弱分子運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)熒光染料結(jié)合的穩(wěn)定性和減少可能的熒光損耗。

4.Q：腫瘤細(xì)胞測(cè)周期。70％乙醇是否必須用PBS和乙醇配，用水配細(xì)胞會(huì)碎裂，PBS和乙醇配會(huì)出現(xiàn)絮狀物？上流式前細(xì)胞用75％乙醇固定，使用瓶裝75％乙醇是否可行？

A：先用冷PBS懸浮細(xì)胞，大約1-2ml，充分懸浮，使細(xì)胞充分分散成單細(xì)胞。之后緩慢加入無水乙醇，終濃度為70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)聚的現(xiàn)象，很難重懸成單細(xì)胞。乙醇固定之后沒有細(xì)胞沉淀。

5.Q：流式分析細(xì)胞周期，收集了10的6次方細(xì)胞，但細(xì)胞在乙醇固定之后，還看到有細(xì)胞沉淀的，但PBS洗滌兩次之后，就基本沒什么細(xì)胞沉淀了，上機(jī)發(fā)現(xiàn)看不到細(xì)胞了。這是怎么回事?。吭趺唇鉀Q這個(gè)問題??？

A：很可能是洗細(xì)胞的過程中丟失了，解決辦法有：

（1）盡量采用尖底的離心管和水平離心機(jī)

（2）離心后盡量用吸管吸取上清，不要傾倒；吸上清時(shí)最好殘留1mm左右的水膜，不要吸完。

（3）離心的轉(zhuǎn)速或時(shí)間可稍微增加一點(diǎn)兒

（4）每次加抗體時(shí)，吸頭最好不要接觸液面；混勻時(shí)最好不要用吸頭吹打，以免吸頭掛壁帶走部分細(xì)胞。