熒光顯微鏡的基本原理是借助熒光染料對細(xì)胞成分進(jìn)行高度特異性的可視化觀察。這可能是一種與興趣蛋白質(zhì)遺傳相關(guān)的熒光蛋白，如綠色熒光蛋白（GFP）等。如果克隆無法實現(xiàn)，例如在組織學(xué)樣本上無法實現(xiàn)，則需要使用另一種技術(shù)如免疫熒光染色來對興趣蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化觀察。為此，人們使用抗體來連接不同的熒光染料并將其直接或間接地結(jié)合到適當(dāng)?shù)陌悬c上。此外，借助熒光染料，熒光顯微鏡的應(yīng)用就不再僅局限于蛋白質(zhì)觀察，還能對核酸、多糖和其他結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色，甚至像鈣離子這樣的非生物物質(zhì)也能被檢出。本文就為大家介紹了幾種常用的熒光染料。

   免疫熒光
   在熒光顯微鏡下，有兩種方法可以顯示興趣蛋白質(zhì)?？梢越柚鷥?nèi)在的熒光信號，也就是通過克隆從而在基因?qū)用姘岩粋€熒光蛋白和一個靶蛋白聯(lián)系起來；又或者借助熒光標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合到興趣蛋白質(zhì)上。對于某些生物學(xué)問題來說，后者更為實用甚至更為必要。例如，在組織學(xué)樣本的情況下，通常樣本來自不含任何熒光蛋白的生物體，所以不可能使用熒光蛋白。此外，如果有功能性抗體可用，免疫熒光比熒光蛋白技術(shù)要快得多，因為熒光蛋白方法必須克隆興趣基因并將DNA轉(zhuǎn)染到相應(yīng)細(xì)胞中。熒光蛋白的另一個缺點在于其本身就是一種蛋白質(zhì)。因此細(xì)胞內(nèi)就具備了特定的蛋白質(zhì)特性，因而可能導(dǎo)致功能紊亂或?qū)λY(jié)合的興趣蛋白產(chǎn)生干擾。當(dāng)然，值得注意的是，熒光蛋白通常是觀察活細(xì)胞的首選方法。

   免疫熒光利用抗體對抗原的特異性結(jié)合親和力。此處可存在兩種不同的結(jié)構(gòu)。最簡單的方法是使用一種熒光標(biāo)記的抗體，該抗體與興趣蛋白結(jié)合，稱為直接免疫熒光。

   大多數(shù)情況下會使用兩種形式的抗體。第1抗體與靶蛋白結(jié)合，自身（1st抗體）沒有熒光標(biāo)記。但與第1抗體結(jié)合的第2抗體（2nd抗體）特異性攜帶熒光染料，這種方法被稱為間接免疫熒光。間接免疫熒光有幾個優(yōu)點，一方面會存在放大效應(yīng)，因為不止有一種第2抗體與一種第1抗體結(jié)合。另一方面，針對您興趣蛋白，不需要一直用熒光染料標(biāo)記每種抗體，可以使用市售熒光標(biāo)記的第2抗體。免疫熒光中廣泛使用的熒光染料是FITC、TRITC或以下提到的幾種Alexa Fluor?染料。

   FITC和TRITC
   異硫氰酸熒光素（FITC）是一種有機(jī)熒光染料，目前仍用于免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)當(dāng)中。該染料在495/517nm處存在激發(fā)/發(fā)射峰，而且可借助其反應(yīng)性異硫氰酸酯基團(tuán)與蛋白質(zhì)上的氨基、巰基、咪唑基、酪氨酰或羰基結(jié)合而與不同的抗體偶聯(lián)。它的基本結(jié)構(gòu)，即熒光黃的分子量為332g/mol，常用作熒光示蹤劑。FITC（389g/mol）是最早用于熒光顯微術(shù)的染料之一，也是Alexa-fluor488等熒光染料的來源。它的熒光活性源于其自身的大共軛芳香電子結(jié)構(gòu)，在藍(lán)色光譜中會被光所激發(fā)。

   經(jīng)常與FITC配合使用的一種染料是同出一門的TRITC（四甲基羅丹明-5-（和6）-異硫氰酸酯）。與FITC不同，TRITC不是熒光素，而是羅丹明系列衍生物。羅丹明也存在一個大的共軛芳香電子結(jié)構(gòu)，因此可以發(fā)出熒光。與FITC不一樣，TRITC（479g/mol）在綠色光譜中被激發(fā)，最大值出現(xiàn)在550nm處，最大發(fā)射波長為573nm。與蛋白質(zhì)（如抗體）的結(jié)合也基于反應(yīng)性異硫氰酸酯基團(tuán)。
即使FITC和TRITC仍在使用，但考慮到兩者屬于相當(dāng)弱的熒光染料，不建議用于最先進(jìn)的顯微術(shù)。兩者的優(yōu)勢主要還是在于成本低。

   花青素
   這種相對較小的熒光染料集合源于花青素并因此而得名：Cy2、Cy3、Cy5和Cy7。這些染料都可以通過反應(yīng)基團(tuán)與核酸或蛋白質(zhì)相連。例如，蛋白質(zhì)標(biāo)記使用馬來酰胺基團(tuán)。有趣的是，熒光方面Cy5對周圍的電子環(huán)境很敏感，這可用于酶的測定。黏附蛋白的構(gòu)象變化導(dǎo)致熒光發(fā)射的正負(fù)變化。此外，Cy3和Cy5可用于FRET實驗。花青素染料是比較古老的熒光染料，也是其它熒光染料的基礎(chǔ)，具有亮度高、光穩(wěn)定性好、量子效率高等優(yōu)點。

   在熒光顯微術(shù)中，不僅蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)感興趣，而且對核酸也感興趣。有時有必要通過檢測細(xì)胞核來確定細(xì)胞的確切位置或數(shù)量。最常見的DNA染色劑之一是DAPI（4',6-二氨基-2-苯基吲哚），主要與DNA雙螺旋富含A-T的區(qū)域結(jié)合。與未結(jié)合態(tài)相比，DAPI在DNA上的熒光強(qiáng)度增加。染料被UV（紫外線）光激發(fā)，最大激發(fā)波長為358nm。發(fā)射光譜較寬，峰值在461nm。弱熒光也可以檢測到RNA結(jié)合。在這種情況下，發(fā)射轉(zhuǎn)移到500nm。有趣的是，DAPI能夠滲透完整的細(xì)胞膜。因此，該染料既可用于固定細(xì)胞也可用于活細(xì)胞。

   第二種廣泛使用的DNA染色方法是Hoechst染料，最初由化學(xué)公司Hoechst AG生產(chǎn)。Hoechst 33258、Hoechst 33342和Hoechst 34580都是鄰苯二甲酰亞胺，具有向A-T富集區(qū)插入的趨勢，因此后者不常使用。與DAPI相似，此類染料受到紫外線激發(fā)并在455 nm下發(fā)射最大值，在無結(jié)合狀態(tài)下變?yōu)?10–540 nm。Hoechst染料還具有細(xì)胞滲透作用，因此可用于固定細(xì)胞和活細(xì)胞。與DAPI不同是，Hoechst染料毒性更低。

   DNA染色劑碘化丙啶無法透過細(xì)胞膜。在細(xì)胞培養(yǎng)中，因為該染色劑無法進(jìn)入完好的細(xì)胞內(nèi)，所以常常被用來區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。碘化丙啶也是一種結(jié)合劑，但對不同的堿基沒有特異性。在核酸結(jié)合態(tài)下，其最大激發(fā)波長為538nm，最高發(fā)射波長為617nm。未結(jié)合狀態(tài)下碘化丙啶的最大激發(fā)和發(fā)射被移到較短的波長和較弱的強(qiáng)度。它也可以在不改變其熒光特性的情況下與RNA結(jié)合。要區(qū)分DNA和RNA，必須使用足夠的聚合酶。

   吖啶橙是一種染料，可以在DNA和RNA之間形成差異區(qū)分而無需事先操作。其最大激發(fā)/發(fā)射對在DNA結(jié)合態(tài)為502nm/525nm，在RNA結(jié)合態(tài)為460nm/650nm。此外，該染料還可以進(jìn)入酸性間室中，如溶酶體。陽離子染料在酸性間室中質(zhì)子化。在酸性環(huán)境中，吖啶橙受藍(lán)色光譜中的光激發(fā)，而橙色區(qū)域的發(fā)射最強(qiáng)。因為凋亡細(xì)胞有很多被吞噬的酸性間室，因此也讓該染料成為了這類細(xì)胞常用的標(biāo)記物。

   間室與細(xì)胞器特異性染料
   在熒光顯微鏡下，對細(xì)胞間室如溶酶體或核內(nèi)體和細(xì)胞器如線粒體等進(jìn)行染色通常較為合理。為此，本節(jié)將介紹一組特定染料組合。
觀察線粒體時一種公認(rèn)的方法是使用MitoTracker?。這是一種細(xì)胞滲透性染料，具有溫和的巰基活性氯甲基部分。該染料可以通過與半胱氨酸殘基的自由巰基反應(yīng)，與基質(zhì)蛋白共價結(jié)合。MitoTracker?有不同的顏色和改良成分（見表1），也是Molecular Probes的商標(biāo)。與傳統(tǒng)的線粒體特異性染色劑如羅丹明123或四甲基玫瑰胺不同的是，在用固定劑破壞膜電位后MitoTracker?不會被洗掉。
   根據(jù)線粒體染色情況，還有染料標(biāo)記酸性間室如溶酶體等，稱為LysoTracker。這些是與熒光團(tuán)相連的膜滲透性弱堿。由于質(zhì)子化作用，這些堿很有可能與酸性間室有親和力。LysoTracker也有不同的顏色。

   與溶酶體類似的間室為真菌液泡，如釀酒酵母。這種薄膜包圍的空間也具有酸性。在熒光顯微鏡下觀察它的方法之一是使用苯乙烯基染料，如FM 4-64?或FM 5-95?。

   在蛋白質(zhì)分泌實驗方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）尤為值得注意。對這種間室進(jìn)行染色的一種經(jīng)典染料是DiOC6(3)。這種染料雖然偏向與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，但也能與線粒體膜等其他膜結(jié)合。另一種特定染色ER的方法是使用ER-Tracker，如綠色和紅色ER-Tracker。這兩種染料都是以BODIPY為基礎(chǔ)的染料，與格列本脲（一種磺酰脲酶）有關(guān)，能與ER膜上特有的ATP敏感鉀通道結(jié)合。BODIPY（硼二吡咯甲基）描述了一組相對pH不敏感的染料，這些染料幾乎都不溶于水。這類染料并不是很好的蛋白質(zhì)標(biāo)記工具，但用于脂質(zhì)和膜標(biāo)記時效果較佳。

   ER相近間室 – 高爾基體 – 可用熒光神經(jīng)酰胺類似物如 NBD C6-神經(jīng)酰胺和BODIPY FL C5-神經(jīng)酰胺進(jìn)行標(biāo)示。神經(jīng)酰胺是高爾基體中所富含的鞘脂。

   在進(jìn)一步脂質(zhì)基染料的幫助下還有可能對特殊的膜區(qū)域，如脂質(zhì)筏等進(jìn)行染色。這些富含膽固醇的結(jié)構(gòu)域可以通過使用NBD-6膽固醇或NBP-12膽固醇等（Avanti極性脂質(zhì)）來進(jìn)行可視化觀察。

   除了使用特殊的非蛋白熒光染料來標(biāo)記細(xì)胞間室外，還可以借助于對細(xì)胞中不同位置有偏好的蛋白質(zhì)來染色興趣區(qū)域。這些蛋白質(zhì)可以連接到熒光染料上，并在熒光顯微鏡下顯示出來。這種方法的一個例子是小麥胚芽凝集素（WGA）的使用，它與存在于質(zhì)膜中的唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖基特異結(jié)合。WGA與熒光染料偶聯(lián)。用它可以觀察到質(zhì)膜。